В рамках информационного партнёрства с научно-популярным сайтом biomolecula.ru публикуем журнальный вариант статьи, которая была представлена на конкурс «Био/мол/текст»-2024/2025 в номинации «Своя работа».
Часто ли вы задумываетесь, где родился и вырос лосось, лежащий у вас на тарелке? Если ещё век назад это могла быть рыба, выловленная из моря, реки или озера, то сейчас жителям мегаполисов о таком приходится только мечтать. Большая доля рыбы и беспозвоночных гидробионтов, лежащих на прилавках супермаркетов, — продукты аквакультуры.
Искусственное разведение некоторых видов рыб (карповых и нильской тиляпии) вошло в наш обиход давно. В Китае уже во втором тысячелетии до н. э. карпов (Cyprinus carpio) разводили в прудах, а также на рисовых чеках. А в недавней работе зооархеологи обнаружили остатки костей молодых и взрослых особей карпа возрастом около 8 тысяч лет. Вероятно, жители неолитического Китая вылавливали взрослую рыбу для еды, а мальков — для последующего воспроизводства. Выращивание карповых в странах Азии остаётся популярным и в настоящее время, что обеспечивает пищевые потребности быстрорастущего населения. Культ нильской тиляпии (Oreochromis niloticus) существовал в Древнем Египте, ей поклонялись, как священному животному. Для её выращивания строили специальные бассейны. О любви древних египтян к этой вкусной рыбе можно судить по многочисленным изображениям на фресках, стенах гробниц и других произведениях искусства. Образ тиляпии присутствует и в египетской письменности, где он служит элементом одного из иероглифов.
На сегодняшний день аквакультура — активно развивающееся направление сельского хозяйства во всём мире. Согласно последнему докладу Агентства мирового рыболовства и аквакультуры (The State of World Fisheries and Aquaculture, SOFIA), объём искусственно произведённой продукции в 2022 году составил 223,2 млн т, то есть более половины всей рыбы и беспозвоночных гидробионтов, поставляемых на рынок.
Россия не входит в число лидеров по производству аквакультурной продукции, причина тому — развитое морское рыболовство, способное удовлетворить потребности населения в дикой рыбе. Кроме того, рост индустриальной аквакультуры в стране существенно сдерживает проблема разработки и производства искусственных кормов (научные разработки ведут, но в небольшом объёме). Хотя в последнее время интерес к этой продукции растёт, и в 2023 году её производство в России выросло на 4,8% по сравнению с предшествующим годом, достигнув 402 тыс. т. Основные виды, выращиваемые в нашей стране искусственно, — рыбы (лососёвые, карповые, осетровые), а также другие ценные жители моря — устрицы, мидии, гребешки и иные моллюски, иглокожие.
В ТЕСНОТЕ, ДА НЕ В ОБИДЕ?
В отличие от жителей морей, озёр и рек, развивающихся в диких условиях, их аквакультурные собратья существенно стеснены в квадратных метрах. Встречаются различные виды «коммунальных квартир» для выращивания рыбы в искусственных условиях: лиманы (лагуны, пруды), садки, бассейны, устройства замкнутого водоснабжения. И везде ведут контроль за множеством параметров, основные из которых — плотность посадки, водообмен, режим кормления, температура, аэрация.
Искусственное разведение рыбы связано с определёнными рисками. Среди них — высокая подверженность инфекционным заболеваниям, которые молниеносно распространяются среди большого количества особей одного вида, содержащихся совместно при высокой плотности. Такие эпидемии могут приводить к стопроцентной гибели рыб, а значит, к огромным экономическим уронам для аквахозяйств. Для лечения инфекций у рыб используют антибактериальные препараты. Однако растущая устойчивость к ним микроорганизмов и жёсткие требования к содержанию антибиотиков в рыбной продукции и окружающей среде существенно ограничивают их применение. Предпочтительнее проводить вакцинацию, которая даёт возможность противостоять не только бактериям, но и вирусам.
Впервые идея вакцинировать рыб для защиты от инфекций родилась у исследователей из Ягеллонского университета в Кракове (Польша) в 1938 году. Работа была опубликована на польском языке, что существенно ограничило её распространение в научном сообществе. Эстафету в 1942 году подхватили канадские специалисты-иммунологи во главе с Д. С. Даффом с Тихоокеанской биологической станции при Университете Британской Колумбии, опубликовавшие статью в The Journal of Immunology. В работе они сообщили, что атлантического лосося, сёмгу (Salmo salar), можно защитить от патогенного микроорганизма Aeromonas salmonicida путём пероральной вакцинации убитыми формалином бактериями. С тех пор количество разрабатываемых вакцин для аквакультуры неуклонно растёт. На сегодняшний день в мире коммерчески доступны несколько десятков лицензированных вакцин для использования на различных видах рыб и ещё около 150 находятся на этапе внедрения.
Технологии разработки и производства вакцин для аквакультурных видов существенно не отличаются от таковых для млекопитающих. И типы вакцин, которые используют для иммунопрофилактики заболеваний у рыб или креветок (да-да, этим ракообразным тоже делают прививки), вполне себе «человеческие». Это живые аттенуированные вакцины, инактивированные вакцины, субъединичные вакцины на основе рекомбинантных белков и пептидов, ДНК-вакцины, вакцины на основе вирусных векторов.
До сих пор основу рынка вакцин для аквакультуры составляют цельноклеточные инактивированные препараты, полученные по классической технологии, предложенной ещё Луи Пастером. Это связано, прежде всего, с экономической целесообразностью — у очень дорогой вакцины нового поколения есть большой шанс остаться невостребованной на рынке. Учитывая тот факт, что активные участники мировой аквакультуры — развивающиеся страны, такие как Египет, Индонезия, Индия, Чили, Мексика, где часто людям просто нечего есть, вопрос о внедрении новых технологий и вакцин для аквакультуры там не стоит на первом месте. Поэтому, как и в конце XIX века, современные производители вакцин выделяют патоген из заражённых рыб, культивируют его и инактивируют с помощью химических или физических методов. Данный процесс сводит на нет способность микроорганизмов вызывать заболевание (вирулентность), одновременно сохраняя у них антигенные свойства, то есть способность активировать иммунный ответ. Цельноклеточные инактивированные вакцины обладают высоким уровнем безопасности, хотя их иммуногенность считается низкой.
Тем не менее среди коммерческих препаратов встречаются и более современные. В 2005 году одна известная фармацевтическая компания внедрила в Канаде ДНК-вакцину против инфекционного некроза гемопоэтической ткани лосося (Infectious hematopoietic necrosis, IHN). Разработку данной вакцины стимулировала эпидемия IHN-вируса. С 2001 по 2003 год рыба на 36 канадских фермах была поражена этой вирусной инфекцией, причём наблюдалась 70%-ная смертность среди рыбы весом менее 1 кг и 40—50%-ная смертность у особей большего веса. Аквакультура атлантического лосося в Канаде в те годы потерпела огромные финансовые убытки и оказалась на грани банкротства. На помощь канадским фермерам пришла плазмида Apex-IHN, несущая ген гликопротеина вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани.
Чем же так хороша плазмида? Эти маленькие и независимые кольцевые молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), впервые найденные вне хромосомы в бактериальной клетке, могут самостоятельно размножаться и быть «изгнанными клеткой», тем самым обмениваться с соседними клетками генетической информацией. В природе плазмиды чаще всего включают гены, которые помогают бактериям лучше адаптироваться к условиям среды, например, обеспечивая защиту от антибиотиков. В настоящее время плазмиды обнаружены у некоторых архей, грибов и высших растений. Умение этих молекул быстро и самостоятельно размножаться и передавать генетический материал соседу давно привлекает молекулярных биологов. Искусственно конструируя плазмиду, можно вставлять в неё интересующий ген, а затем переносить его в клетки — так получается новое лекарство для генной терапии или ДНК-вакцина. Тем не менее клетки млекопитающих и рыб совсем не склонны пропускать через ворота клеточной мембраны чужаков такого большого размера (в отличие от бактерий). Здесь на помощь приходят различные ухищрения. Одно из них — упаковка таких молекул ДНК в оболочку из природных полимеров, о чём будет рассказано далее.
ОСОБЕННОСТИ ПРПРИМЕНЕНИЯ ВАКЦИН ДЛЯ АКВАКУКУЛЬТУРУРЫ
Рыбы — пойкилотермные животные. Это значит, что их настроение, температура и иммунный ответ существенно зависят от температуры окружающей среды, что надо учитывать при выборе «сезона» вакцинации.
Репертуар иммуноглобулинов у рыб существенно отличается от млекопитающих. У костистых рыб встречаются четыре основных изотипа: IgH, IgM, IgD и IgT/Z. Иммунитет слизистых оболочек рыбы в основном обеспечивает изотип IgT. IgM — преобладающий изотип иммуноглобулинов в жидкостях организма костистых рыб. Он считается наиболее распространённым изотипом антител и часто обнаруживается в плазме или сыворотке.
При разработке пероральных вакцин надо иметь в виду, что строение ЖКТ у различных таксонов рыб отличается. У некоторых систематических групп (семейства Cyprinidae и Labridae) отсутствует желудок. У многих хищных рыб (имеющих желудок) в части кишечника, непосредственно прилегающей к желудку, есть слепые выросты — пилорические придатки. В ряде случаев к пищеварительным органам рыб относится жаберный аппарат, образования которого — жаберные тычинки — обеспечивают функцию захвата и фильтрации пищи.
При слове «прививка» сразу вспоминается шприц с иглой, мысль о котором у многих вызывает страх. А боятся ли прививок рыбы? Конечно. Они испытывают большой стресс, пытаясь быстро выскользнуть из человеческих рук. Поэтому для проведения инъекции используется анестезия. Но эти манипуляции в неумелых руках могут привести к высокой летальности рыб и потому требуют высокой квалификации персонала. Кроме того, внутрибрюшинные инъекции используют только для особей весом более 15 г, что ограничивает применение этого способа вакцинации для мелких гидробионтов и мальков рыб. Несмотря на это, инъекции остаются самым эффективным и основным способом вакцинации в аквакультуре. Не стоит забывать, что очередь на «прививку» из скользких пациентов иногда измеряется тоннами, что требует автоматизации процедуры. Больших успехов в этом направлении достигли компании Maskon (Норвегия) и Aqualife (Великобритания). Норвежские специалисты сконструировали полностью автоматическую систему, которая управляется одним оператором и способна вакцинировать и сортировать до 40 000 мальков сёмги в час. Машина может одновременно вводить до четырёх различных вакцин внутрибрюшинно или внутримышечно. Их английские коллеги создали аппарат, управляемый системой технического зрения, которая способна распознавать особенности строения рыбы и определять место вакцинации.
А как быть аквахозяйствам, у которых нет доступа к такому высокотехнологичному оборудованию? Ответ прост — выполнять инъекции вручную. Также можно использовать корм, содержащий вакцину (пероральное введение), или устраивать рыбе специальные «вакцинные ванны» (иммерсионное введение). Эти два способа очень привлекательны, так как сопряжены с минимальным стрессом для рыбы и не требуют специальных навыков персонала. К сожалению, они не всегда эффективны из-за низкой биодоступности, связанной с плохой проницаемостью эпителия (кожи, жабр, кишечника), и быстрой деградации вакцины в желудочно-кишечном тракте рыб. Тем не менее действенность таких иммунопрепаратов не равна нулю. Это подтвердили ещё первые эксперименты по вакцинации в аквакультуре в 1942 году, проводимые группой Даффа, и последующие многочисленные научные исследования в этой области.
Истории успеха пероральной и интраназальной (введение через нос) вакцинации известны как медицине, так и ветеринарии. Один из самых ярких примеров — значительный прогресс в борьбе с полиомиелитом благодаря пероральной вакцине, разработанной в середине XX века американскими вирусологами под руководством Джонаса Солка в тесном сотрудничестве с советскими учёными Михаилом Чумаковым и Анатолием Смородинцевым. Слаженная работа Глобальной инициативы (The Global Polio Eradication Initiative — GPEI) по борьбе с данной инфекцией позволила сократить распространение этого вируса по планете на 99% и спасти около 16 млн человек, которые могли бы стать инвалидами или погибнуть.
В ветеринарии широко используется пероральная и/или интраназальная вакцина против болезни Ньюкасла — псевдочумы птиц, или азиатской чумы птиц. Это позволяет птицеводам не нести огромные экономические потери в случае, когда вирус неожиданно заглянул в гости на ферму или птицефабрику.
В настоящее время коммерческих пероральных вакцин для аквакультуры не так много — они пока недостаточно эффективны и есть проблемы, связанные с производством большого количества необходимых антигенов, обеспечивающих эффективный иммунный ответ на местном и системном уровне. К тому же антигены должны быть защищены от разрушения до того, как достигнут мест, где происходит индукция иммунитета. Требуются дополнительные исследования, чтобы создать более совершенные препараты и сделать их менее уязвимыми к действию агрессивной среды желудка.
Подобными исследованиями занимается и небольшая молодёжная группа, работающая над созданием прототипа эффективной пероральной ДНК-вакцины для аквакультуры*, которую я возглавляю. Команда многопрофильная и включает исследователей из разных научных институтов Москвы и Санкт-Петербурга. Сотрудники лаборатории природных полимеров филиала НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ-ИВС (Санкт-Петербург) выполняют химическую часть работы. Трудоёмкие и очень ответственные рыбоводческие эксперименты ведут сотрудники Санкт-Петербургского филиала Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии. Биологическую активность прототипов вакцин изучают коллеги из Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.
На первом этапе работы мы используем модельную плазмиду, несущую ген зелёного флуоресцентного белка (GFP). Благодаря этому белку можно оценивать «судьбу» вакцины (отслеживать её распространение), наблюдая яркое зеленоватое свечение в клетках и тканях рыб. В дальнейшем в такую конструкцию можно вставлять любой ген интереса, обеспечивающий экспрессию белка-патогена. Для защиты кольцевой молекулы ДНК (плазмиды) от быстрой деградации в желудочно-кишечном тракте рыбы мы предлагаем послойно её упаковать в природные полисахариды — хитозан и альгинат. Учитывая, что в кислой среде альгинат нерастворим, он будет, как броня, защищать плазмиду от разрушения желудочным соком. Таким образом, действующее начало вакцины (кольцевая ДНК) сможет сохранить свою активность и продолжить своё путешествие в кишечнике. Не стоит забывать, что эпителий кишечника — прочная стена, проникнуть через которую непросто. Чтобы преодолеть это препятствие, мы предлагаем присоединить к альгинатной оболочке синтетический пептид AT1002 (ZOT-1), способный кратковременно открывать плотные межклеточные контакты в эпителиальных клетках. Предположим, что стена пробита и плазмида попала в кровоток, но проникнуть в ядро клетки для синтеза зелёного флуоресцентного белка (GFP) не так-то просто. Изначально в качестве агента, помогающего кольцевой молекуле ДНК проникнуть через клеточную мембрану, предполагалось использовать хитозан (об этом его свойстве известно из множества научных публикаций). Но предварительные эксперименты, проведённые на рыбных клеточных линиях, показали, что одного хитозана недостаточно и необходимо привлечь ещё и молекулы, имеющие большое сродство к клеточной мембране, — липиды.
«ВАКЦИННЫЕ ВАННЫ» ДЛЯ РЫБ
Экзотический для млекопитающих способ вакцинации — купание, или иммерсия, широко используется для защиты от инфекций рыб и ракообразных. Он прост в исполнении и реализуется в двух вариантах: погружение «пациента» в раствор вакцины на время от одной минуты до нескольких часов («купание») и экспозиция в ванной с большим содержанием соли (солевой раствор позволяет временно увеличить проницаемость кожных покровов и слизистой жабр и увеличить эффективность вакцинации) и последующим купанием в растворе вакцины («двойное купание»).
Метод активно используется за рубежом. В России известно лишь об экспериментальной работе в этом направлении: в 2006 году в лаборатории ихтиопатологии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко РАН этот способ вакцинации радужной форели (Oncorhynchus mykiss) впервые применили против вибриоза — заболевания, вызываемого микроорганизмами рода Vibrio. Тогда, в июле 2006 года, на одном из садковых хозяйств по разведению радужной форели в Белом море была выявлена вспышка этой болезни. Существенных потерь удалось избежать, применяя ударные дозы антибиотиков и менее плотную посадку рыб, но встал вопрос о проведении иммунопрофилактики в будущем. Вспомнив об успешном мировом опыте вакцинации иммерсионным методом, сотрудники ВНИИ экспериментальной ветеринарии решили применить этот способ прививки к 50 тысячам экземпляров рыб, используя инактивированную вакцину против Vibrio anguillarum. Три недели содержания в пресной воде с вакциной (Шагозеро) дали незначительный иммунный ответ. Позже, во время перевозки в морские садки, была проведена повторная вакцинация поголовья, что обеспечило более выраженную защиту.
Рыбы в российских аквахозяйствах ничем не отличаются от зарубежных со-братьев и болеют так же часто. Основным способом лечения бактериальных инфекций рыб по-прежнему остаётся лекар-
ственная терапия, которая оказывается не всегда эффективной. В случае вирусных эпидемий российские рыбоводы и вовсе бессильны. Поэтому необходима срочная разработка противовирусных вакцин, особенно актуальная в случае выращивания лосося. Почему же раньше проблема не стояла так остро? Дело в том, что ранее весь смолт (молодь лосося) импортировали из Норвегии уже привитым. В условиях санкций поставки западноевропейских антивирусных вакцин и вакцинированной молоди практически прекратились.
В августе 2024 исследователи из Федерального центра охраны здоровья животных вместе с коллегами из Всероссийского государственного Центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов разработали первую отечественную шестивалент-ную вакцину (шестивалентной вакциной называется препарат, содержащий сразу шесть разных антигенов или комбинаций антигенов, направленных против шести различных патогенов или штаммов одной болезни. — Прим. ред.), защищающую лососёвых от вируса инфекционного некроза поджелудочной железы, фурункулёза, вибриоза, холодноводного вибриоза и зимней язвенной болезни. В специально созданном аквариальном комплексе провели испытания вакцины на 5 млн особей радужной форели и атлантического лосося, которые оказались успешными. И теперь разработка ждёт регистрации и скорого выхода на рынок.
Вышеупомянутые вакцины — «классические», полученные на основе инактивированного возбудителя. Но известны и разработки отечественных ДНК-вакцин. Сотрудники Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (г. Новосибирск) запатентовали плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию поверхностного антигена, который содержится в оболочке вируса, поражающего карповых. ДНК-вакцина на основе таких ДНК-плазмид обеспечивает развитие у рыб защитного иммунитета против заражения вирусом весенней виремии карпа. В этом же научном центре в другом исследовании использовали различные генно-инженерные конструкции, содержащие белок оболочки вируса весенней виремии карпа, для вакцинации рыб внутрибрюшинным и внутримышечным путём, которые продемонстрировали эффективность и перспективность. Надеемся, что в ближайшем будущем российский рынок вакцин для аквакультуры пополнится новыми препаратами. Помогут в этом мировой опыт и разработки отечественных учёных.
0
210.00
